Max Eisele et Bernhard Wolfring1, Vincent Aubertin2,
1 TOPTICA Photonics AG, Lochhamer Schlag 19, 82166 Graefelfing (Munich) : max.eisele@toptica.co, bernhard.wolfring@toptica.com
2 Opton Laser International, 29, rue Jean Rostand, 91893 Orsay : vincent.aubertin@optonlaser.com

Introduction

Comprendre la structure et la fonction des constituants de la matière organique au niveau cellulaire a toujours été un objectif majeur de la microscopie optique. Pour cette application, la microscopie linéaire à un photon, comme la microscopie à fluorescence, était traditionnellement utilisée pour la génération de contraste. Cependant, en raison de l'absorption et de la diffusion de la lumière, cette technique est limitée à l'imagerie du tissu près de la surface et souffre d'une forte dégradation de la résolution optique avec l'augmentation de la profondeur de sondage.

Le développement de la microscopie optique non linéaire, en particulier de la microscopie à deux photons et de la microscopie par génération de seconde harmonique (SHG), a permis de résoudre ce problème. Par rapport à la microscopie linéaire, le caractère non linéaire de la microscopie à deux photons présente plusieurs avantages énormes en ce qui concerne l'imagerie des tissus profonds, la détection de signal, la photodécoration et l'imagerie in vivo.

Avec la disponibilité de sources laser femtosecondes clés en main, robustes et économiques basées sur la technologie laser à fibre, la microscopie optique non linéaire est maintenant largement disponible pour que tout le monde puisse l'utiliser sans complexité élevée.

Figure 1 : FemtoFiber ultra 920. L’unité de commande et d’alimentation est intégrée à un rack standard de type 19 ”qui est connecté via une fibre amovible à la tête laser pour une intégration OEM simple. Le système laser et ses caractéristiques uniques constituent le choix idéal pour la microscopie non linéaire, telle que l’excitation à deux photons de protéines fluorescentes. Toptica FemtoFiber 920nm

 

Avec sa conception robuste et compacte, le FemtoFiber ultra 920 est un système laser facile d’utilisation et ne nécessitant aucune maintenance. Le nouveau concept du laser propose une durée d'impulsion <100 fs avec une longueur d'onde centrale de 920 nm et une puissance moyenne de 1,5 Watt (18,5 nJ à une fréquence de répétition de 80 MHz). Les caractéristiques temporelles et spatiales du faisceau laser sans égales sont parfaitement adaptées à la microscopie non linéaire des tissus profonds, offrant un contraste optique et un rapport signal sur bruit  excellents.

Microscopie à deux photons

La microscopie à fluorescence conventionnelle est basée sur l'absorption d'un photon unique qui engendre un électron d’une molécule fluorescente dans un état excité. Lors de la relaxation vibratoire, l'électron excité retourne à son état fondamental en émettant un seul photon à décalage Stokes (Fig.2 a). En utilisant des schémas d'épi-microscopie, des images de la distribution des fluorophores à la surface de l'échantillon peuvent être enregistrées. En raison de l'excitation d'un photon dans la microscopie à fluorescence conventionnelle, cette approche souffre d'un fort rayonnement de fond conduisant à un flou de l'image (Fig.2b).

Figure 2 : a- Illustration du processus d'absorption à un photon et à deux photons pour l'excitation de fluorescence. b-confinement spatial de la génération de signal de fluorescence en microscopie à fluorescence conventionnelle et en microscopie à deux photons.

Un microscope confocal est utilisé pour augmenter la résolution spatiale et supprimer les effets indésirables de fluorescence provenant de zones situées en dehors du plan focal. Du fait de la réduction du rayonnement de fond indésirable basé sur l’ouverture, une imagerie tridimensionnelle des tissus peut également être réalisée avec une profondeur de sondage jusqu’à 100 µm, principalement limitée par l’absorption et la diffusion de la lumière d’excitation.

L'utilisation de la microscopie à deux photons est une approche plus sophistiquée de la microscopie à fluorescence des tissus profonds à haute résolution. Ici, deux photons avec une énergie de photon environ la moitié de l'énergie de photon pour la microscopie à fluorescence conventionnelle sont utilisés pour exciter une molécule.

Cette méthode offre des avantages significatifs :

  1. En raison de la faible énergie des photons, l'absorption et la diffusion du rayonnement d'excitation sont fortement réduites, ce qui conduit à une profondeur de sondage beaucoup plus grande dans l'imagerie des tissus profonds jusqu'à 1 mm.
  2. La détection du signal ne nécessite pas de filtrage spatial comme dans la microscopie confocale, car l'excitation de fluorescence est limitée au plan focal du microscope (Fig.2b). De plus, en raison de la longueur d'onde d'excitation et de détection extrêmement différente, aucun filtrage optique n'est nécessaire.
  3. Le décalage de longueur d'onde vers le proche infrarouge se traduit directement par une réduction du photodamage au sein de l'échantillon pouvant être induite par les photons à haute énergie.
  4. L'énergie photonique plus faible de la lumière d'excitation réduit la photo-toxicité et convient donc parfaitement à l'imagerie in vivo.

Étant donné que la microscopie non linéaire à deux photons nécessite une densité de photons élevée pour être efficace, des lasers femtosecondes intenses avec  une durée d'impulsion inférieure à 100 fs sont nécessaires. Le laser présente des taux de répétition de 80 MHz avec une énergie d’impulsion de plusieurs nJ.
Bien que de nombreuses techniques de spectroscopie et de microscopie non linéaires aient utilisé des lasers au titane-saphir par le passé, les percées récentes dans la technologie laser ont rendu la technologie des lasers à fibre comme une alternative aux lasers Ti-Sa. Les lasers à fibre offrent une flexibilité et une modularité inégalées, associés à un fonctionnement robuste et fiable qui se prêtent à une utilisation dans les laboratoires médicaux ou biologiques.

Figure 3 : a- Spectre d'émission laser du FemtoFiber ultra 920 centré sur une longueur d'onde de 922 nm avec une largeur de bande FWHM de 15 nm. b- trace d’autocorrélation du FemtoFiber ultra 920 avec une durée d’impulsion <100 fs avec 99% de l’énergie des impulsions au sein de l’impulsion principale.

FemtoFiber ultra 920

Jusqu'à présent, les longueurs d'onde autour des 920 nm pour traiter les protéines fluorescentes vertes (GFP) et autres fluorophores constituaient un défi pour les lasers à fibre. Pour résoudre cette limitation, TOPTICA Photonics a mis au point le nouveau FemtoFiber ultra 920, le dernier-né des lasers à fibre haute puissance industriels de TOPTICA, à 780 nm et 1050 nm.

Optimisé pour l'imagerie in vivo des tissus profonds, le laser dispose d'une longueur d'onde centrale de 920 nm (Fig. 3a) pour exciter efficacement la GFP et les autres fluorophores. La combinaison unique d'une durée d'impulsion <100 fs avec une puissance de sortie > 1,5 W à un taux de répétition de 80 MHz permet d'obtenir une puissance crête de plus de 185 kW non-comparable à celle des autres lasers à fibre dans cette gamme de longueurs d'onde.

Un soin particulier a également été utilisé lors de la conception des paramètres de faisceau spatio-temporels du FemtoFiber ultra 920. Typiquement, 99% de l'énergie des impulsions sont comprimées temporairement dans l'impulsion principale (Fig. 3b), ce qui permet une utilisation très efficace de chaque photon. pour une excitation de fluorescence à deux photons réduisant les charges thermiques indésirables sur l'échantillon. En outre, la qualité du faisceau spatial présente d'excellentes caractéristiques de M2 <1,2 (typ. <1,1), ce qui conduit à une taille de point focal minimale limitée par diffraction dans l'expérience.

L'efficacité d'excitation de la fluorescence à deux photons étant proportionnelle au carré de l'intensité du laser dans le plan focal, la combinaison impressionnante de  la puissance de crête, de la forme d'impulsion temporelle et de la qualité du faisceau spatial font du FemtoFiber ultra 920 le choix ultime pour la microscopie à deux photons.

Spécifications :

  • Longueur d’onde: 920 nm
  • Puissance de sortie : >1.5 W
  • Energie impulsion : >18.5 nJ
  • Durée d’impulsion : <100 fs
  • Puissance crête : >185 kW
  • Taux de répétition : 80 MHz
  • M² : <1.2 (typ. <1.1)

Le FemtoFiber ultra 920 est livré avec une tête laser  ultra-compacte d’un encombrement de seulement 23 x 15,5 cm² (Fig. 1). La tête laser est conçue pour assurer une dissipation de chaleur minimale dans son environnement, en offrant une stabilité maximale en ce qui concerne le pointage du faisceau. La conception de la tête laser permet également un montage dans différentes orientations,  verticalement ou horizontalement. L’unité de commande et d’alimentation du système laser est intégrée dans un rack standard de type 19 “(hauteur de 3 unités), qui est relié à la tête laser par une fibre amovible et des câbles de 2 mètres de long. Aucun refroidissement par eau n'est requis, le refroidissement par convection de l'unité de commande / alimentation est suffisant pour un fonctionnement stable du système. En plus du fonctionnement manuel, le système laser peut également être contrôlé à distance via Ethernet ou USB. Une interface graphique simple permet un accès convivial à tous les paramètres du laser.

Figure 4 : Images de microscopie à deux photons utilisant le FemtoFiber ultra 920 pour une excitation par fluorescence. a, -image d'une cellule souche humaine exprimant la GFP attachée à son réseau d'actine. b- Cellule souche humaine avec marquage ATTO594 du réseau d'actine et marquage DAPI du noyau cellulaire. c - bactérie S. pneumoniae marquée avec DAPI.

Caractéristiques principales :

  • Options AOM et GDD disponibles
  • Tête laser ultra-compacte et indépendante, optimisée pour une intégration OEM
  • Excellente stabilité du faisceau garantie par toutes les fibres proposées
  • Fibre à maintien de polarisation uniquement
  • Puissance de sortie variable et évolutive 1-100%
  • Solution laser multicolore disponible (Exemple 780 nm, 1050 nm)
  • Contrôleur laser refroidi par air basé sur un rack de 19"
  • 24 V CC, consommation <150 W

FemtoFiber ultra 920 pour la microscopie à deux photons

L’excellente performance du FemtoFiber ultra 920 pour la microscopie à deux photons est démontrée dans une expérience de validation du concept par le groupe de recherche du professeur Thomas Hellerer de l’Université des Sciences Appliquées de Munich. En utilisant le FemtoFiber ultra 920, des images haute résolution en microscopie à deux photons d'une cellule souche humaine exprimant la GFP attachée à son réseau d'actine sont enregistrées, résolvant ainsi clairement le réseau d'actine dans la cellule (figure 4a). De plus, le FemtoFiber ultra 920 peut être utilisé pour la microscopie à deux photons, par exemple : des cellules souches humaines avec l'actine marquée ATTO594 et un noyau marqué DAPI (Fig. 4b), des bactéries S. pneumoniae marquées avec ATTO425 (Fig. 4c), ou d'autres fluorophores adaptés à une excitation à deux photons à 920 nm.

Note : Toutes les images ont été enregistrées par le groupe de recherche du professeur Thomas Hellerer de l'Université des sciences appliquées de Munich.

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