Lasers à fibre pour la microscopie à deux photons

La microscopie multiphotonique est un outil de recherche puissant qui combine les techniques optiques avancées du microscope confocal avec une excitation multiphotonique avec de grandes longueurs d'onde pour imager des échantillons en haute résolution en 3 dimensions avec des fluorochromes très spécifiques. Cet outil est particulièrement utile pour les biologistes qui souhaitent étudier des mécanismes dynamiques dans les tissus ou cellules vivantes sans infliger des dommages potentiellement létaux à l'échantillon.

Bien que la microscopie classique en champ large offre une résolution inférieure au micromètre, cette technique est limitée en sensibilité et en résolution spatiale par le bruit de fond provoqué par la fluorescence hors du plan focal. L'excitation en microscopie multiphotonique provient uniquement du point focal permettant d'obtenir une section optique d'échantillons épais afin de pouvoir faire une reconstitution tri dimensionnelle. Du fait de l'excitation hautement localisée, le photobleaching des fluorophores ainsi que le photodommage de l'échantillon sont réduits ce qui augmente la viabilité de l'échantillon et donc la durée de l'expérience. De plus, l'utilisation d'une source d'excitation infra rouge permet une meilleure pénétration dans le tissus et réduit la diffraction de la lumière observée pour de courtes longueurs d'onde.

Tous ces avantages permettent aux scientifiques de réaliser des expériences sur des échantillons épais ce qui serait impossible avec d'autres microscopes.

Principe de la microscopie biphotonique
La microscopie à deux photons est une technique d'imagerie développée au début des années 90. Elle repose sur la probabilité pour un échantillon d'absorber deux photons de faible énergie quasi simultanément. Le principe d'absorption bi-photonique a été établi par Maria Göppert-Mayer qui a obtenu le Prix Nobel pour cela en 1963 :

Plusieurs photons peuvent être absorbés simultanément par une molécule, l'énergie portée par chacun des photons s'additionne pour atteindre le niveau d'énergie porté par le photon unique .

Goppert-Mayer M. Ann Phys 1931

Ce processus non linéaire de fluorescence est réalisé grâce à des lasers à impulsions courtes (femtosecondes) avec des longueurs d'onde comprises dans la gamme 750-1050nm pour cibler les principaux colorants synthétiques utilisés en microscopie.

Le laser à fibre dopé Er, une source classique pour la microscopie multiphotonique
La longueur d'onde fondamentale d'un laser à fibre dopé Er (1550nm) peut être facilement doublée en fréquence pour obtenir 780nm, une longueur d'onde adaptée à beaucoup de colorants. Les lasers à fibre utilisent comme milieu amplificateur une fibre dopée avec des ions de terres rares (par ex Er, Yb), ils sont très compacts et peu sensibles aux conditions environnementales. Ils ont l'avantage de présenter une simplicité d'utilisation et une fiabilité bien supérieures aux lasers Ti:Sa classiques.
 

Le FemtoFiber dichro, un concept novateur pour de nouvelles longueurs d'ondes d'excitation
Le laser FemtoFiber dichro de Toptica Photonics offre une nouvelle approche. Ce laser à fibre émet deux longueurs d'onde sur une unique sortie : 780nm et 1030nm qui est obtenu par un décalage en fréquence dans une fibre optique non linéaire. Comme ces deux longueurs d'onde sont générées par le même oscillateur, elle sont parfaitement synchronisées temporellement. Avec une ligne à retard, un décalage temporel peut être introduit. Le laser émet ces deux longueurs d'onde de façon colinéaire pour un parfait recouvrement spatial sur l'échantillon.

Cette excitation à 780nm + 1030nm revient à exciter virtuellement avec 2 photons à 888nm, offrant ainsi un nouveau schéma d'excitation.

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Contact : Vincent Aubertin